真菌感染對人類健康的威脅日益加劇，全球每年超過150萬人因此死亡。唑類藥物作為臨床一線抗真菌藥物，被廣泛用于治療各類真菌感染。然而，随着唑類藥物的長期應用，耐藥性問題變得愈加緊迫。在病原真菌中，多藥耐藥轉運體介導的唑類藥物外排是導緻耐藥的重要機制之一。以白色念珠菌（最常見的病原真菌）為例，其ABC轉運體Cdr1被認為是介導唑類藥物耐藥的關鍵因素。盡管白色念珠菌Cdr1的同源蛋白Pdr5的結構已被解析，但Pdr5結合唑類藥物的關鍵結構域仍未被成功捕獲，因此外排泵Cdr1如何識别和外排各種唑類藥物的機制仍不明了。
米爾貝肟(milbemycin oxime)是一種已被FDA批準用于動物（如貓、狗等寵物）的驅蟲劑，其為米爾貝黴素的肟形式化合物。研究顯示，唑類藥物與米爾貝肟A3/A4組合用于治療由臨床分離的唑類耐藥白色念珠菌引起的小鼠全身感染，效果顯著。盡管米爾貝肟在細胞和小鼠水平上顯示了抑制Cdr1外排泵功能的潛力，但其具體的結合及抑制機制仍不清楚。理解米爾貝肟的抑制機理對于開發針對外排泵Cdr1的新型抑制劑至關重要。
近日，2003网站太阳集团/附屬醫院嚴照峰教授團隊利用單顆粒冷凍電鏡技術，解析了白色念珠菌Cdr1在不同狀态下的三種冷凍電鏡結構：靜息狀态（Cdr1Apo）、氟康唑結合狀态（Cdr1Flu）、以及米爾貝肟結合狀态（Cdr1Mil），其整體分辨率分别為3.38 Å、3.30 Å和3.08 Å。該研究揭示了Cdr1介導氟康唑耐藥及米爾貝肟抑制Cdr1外排的分子機制，為未來開發針對Cdr1的抗真菌藥物奠定了堅實的理論基礎。相關成果以“Cryo-EM structures of Candida albicans Cdr1 reveal azole-substrate recognition and inhibitor blocking mechanisms”為題，于2024年9月6日在線發表于《Nature Communications》雜志。
在Cdr1Flu的結構中，TMD1和TMD2包圍了一個向細胞内側開放的空腔，呈現出向内開放的狀态。氟康唑結合于該空腔的頂部，由TMD1的TM1、TM2、TM5和TMD2的TM8、TM11環繞，通過疏水作用力、氫鍵以及範德華力與周圍的氨基酸相互作用。對空腔内關鍵氨基酸殘基進行單點或多點突變分析後，發現部分氨基酸突變可以逆轉Cdr1對氟康唑的高耐藥性表型。與Pdr5AOV結構相比，TM2、TM5、TM8和TM11的構象變化促使氟康唑從結合空腔中排出。
在Cdr1Mil結構中，米爾貝肟與氟康唑共處于相同的結合腔内，但米爾貝肟占據了整個腔體空間，從而導緻了兩者之間的位阻沖突。同時，米爾貝肟對結合腔的親和力顯著高于氟康唑。此外，米爾貝肟的結合使Cdr1的入口區域關閉，從而阻礙了底物的有效進入。米爾貝肟還顯著抑制了Cdr1的ATP酶水解活性，表明其可能作為一種分子膠，阻礙了Cdr1由内向外的構象轉變。總體而言，米爾貝肟通過競争結合位點、阻止底物進入以及阻礙藥物外排等多重機制，抑制了Cdr1的功能。基于這些結構和功能研究，作者提出了氟康唑轉運與米爾貝肟抑制的模型。
2003网站太阳集团博士生彭穎、鹿炎、孫慧，清華大學博士生馬金英，山西高等創新研究院工程師李小梅，以及2003网站太阳集团碩士生韓曉丹為本文的共同第一作者。2003网站太阳集团/附屬醫院嚴照峰教授和尹孟副教授為本文的共同通訊作者。2003网站太阳集团附屬醫院主任醫師方志雄、2024屆碩士畢業生譚俊明、丘穎琛及屈婷婷也參與了本項研究。本項目得到了國家自然科學基金（32371279、32100972和32200992）、湖南省青年科技人才計劃項目（2021RC3046）、湖南省自然科學基金（2023JJ20007、2022JJ40052和2023SK2081）等資助。嚴照峰教授課題組經費充足，歡迎有志于抗菌藥物研究的青年才俊加入課題組從事博士後研究。
全文鍊接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-52107-w
